皓元新聞

小核酸藥物主要包括反義核酸（ASO）、小干擾核酸（siRNA）、微小RNA（miRNA）、小激活RNA（saRNA）和核酸適配體（Aptamer）。近年來，核酸療法取得了多項突破性成果，目前全球已獲批上市的小核酸藥物共有16款，包括：5款siRNA藥物、9款ASO和2款核酸適配體，約80%的產品是2016年以后上市。小核酸藥物研究已成為全球投資新風口和生物制藥巨頭的必爭之地，核酸療法進入快車道，核酸藥物有望成為繼小分子化藥和抗體藥后的第三大類型藥物。

小核酸具有較強電負性，分子結構不穩定且容易降解，因此為達到提高穩定性、增加結合親和力等效果，小核酸藥物一般需要經過化學修飾。

▲ 寡核苷酸的修飾類型^[1]

小核酸的合成、化學修飾和分離純化是一個復雜的多步驟過程。在這些步驟中，分析技術如同藥物開發過程的眼睛，掌握小核酸的準確分子量、含量、純度以及雜質等信息對各步驟的工藝優化有著指導性的意義。同時這些工藝過程也引入新的雜質，給小核酸藥物的純度和雜質分析增加了難度。特別是以液相、質譜為中心的分析方法，仍存在著重復性差和靈敏度低等諸多技術問題。

皓元醫藥分析服務平臺培養、引進了大批專業人才，配備了大量小核酸分析專用的高端精密儀器，測序軟件等，積累了豐富的小核酸藥物方面的分析經驗。

皓元醫藥基于高效液相的純度分析方法

1. 基于高效液相的純度分析方法開發思路

IP-RPLC法方法開發：

色譜柱、柱溫、流速、流動相組成以及洗脫梯度進行全面考察，確立最佳分析條件，鑒定分離小核酸中的主要雜質。包括變性和非變性反相方法。通過優化離子對試劑種類與濃度、酸性調節劑的比例以及流動相的種類來改善保留、峰型、響應強度、分離度以及質譜電荷價態分布。

AEX法方法開發的思路：

AEX陰離子交換法是利用離子和固定相之間的相互作用的原理，當pH值在6.5到8之間時，小核酸結構中的每個磷酸二酯鍵都帶有一個負電荷。在恒定的pH下，鹽的線性梯度將以增加電荷（因此增加長度）的順序來洗脫小核酸。

SEC法方法開發的思路：

排阻色譜法根據分子的大?。ǚ肿恿亢头肿映叽纾﹣磉M行分離分子，可用于分離單鏈和雙鏈以及分離片段和多聚體的一些雜質。

2. 基于高效液相的純度分析方法開發案例：

流動相對主峰保留的影響：

柱溫對主峰保留和峰型的影響：

柱溫對純度準確性和峰型的影響：

皓元醫藥基于質譜的小核酸的分子量及序列分析

小核酸屬于酸性強極性化合物，每個磷酸二酯鍵上的酸性質子在ESI軟電離過程中均可能發生去質子反應，在 ESI(-) 檢測條件下形成多重電荷形式的離子。

MS分析關鍵及注意事項：

—?減少加合離子Na，K，Fe等金屬陽離子，提高質譜靈敏度；

—?改善待測物的多電荷分布，針對豐度較高的前體離子優化質譜參數；

—?溶液pH值，離子對試劑種類和濃度和有機溶劑組成，影響質譜電荷分布和小核酸離子化效率響應強度；

—?減少特異性吸附，在聚丙烯管和玻璃容器中均存在，提高準確性和重現性。

MS分析小核酸序列解析思路和流程：

▲ 寡核苷酸片段的命名方法^[2]

1.?小核酸的分子量解析案例分享

▲ 圖1? MS Chromatogram result

▲ 圖2? Intact Deconvolution result

2.?寡聚核苷序列解析案例

Inclisiran-AS鏈序列解析結果：

▲ 圖3? Inclisiran-AS MSMS序列分析

▲ 圖4? Inclisiran-AS Fragment Coverage Map

Inclisiran-SS鏈序列解析結果：

▲ 圖5? Inclisiran-SS MSMS序列分析

▲ 圖6? Inclisiran-AS Fragment Coverage Map

我們的優勢

—?儀器資源豐富：配備小核酸專用生物液相UPLC，二維液相質譜2D-HPLC-MS，UPLC-MS，高分辨質譜Thermo Q Exactive和Biopharma Finder專業解析軟件以及其他類ICP-MS，GC，NMR等專用分析儀器。能夠滿足小核酸藥物的質量控制分析；

—?深厚的專業積累：具備小核酸從原料質量控制到小核酸產品合成工藝過程和放行成品的全套一系列分析專業技術經驗，能夠提供小核酸分析的質量控制手段，助力小核酸藥物的開發；

—?高效、高質量和高性價比：可為客戶提供從小核酸原料到成品的質量分析服務，以專業的QC、QA和技術團隊為保障，高效服務，滿足客戶的不同類型的需求；

—?完善的質量管理體系：擁有經驗豐富的小核酸分析人員，配備有先進的分析儀器設備以及完善的質量管理體系，確保數據和資料的真實性、完整性、可靠性和可溯源性，符合法規要求?？蔀榭蛻籼峁┬『怂衢_發全流程的快捷、高效、專業、靈活的分析服務，支持客戶審計和配合官核查。

我們的服務

我們的儀器

Waters UPLC (ACQUITY Premier系統)

Waters UPLC-MS

Thermo scientific Q-Exactive & Vanquish （QE）

Thermo ICAP PQ 電感耦合等離子體質譜儀

參考文獻：

[1] Zahar N M E , Magdy N , El-Kosasy A M ,et al.Chromatographic approaches for the characterization and quality control of therapeutic oligonucleotide impurities[J].Biomedical Chromatography, 2017.DOI:10.1002/bmc.4088.

[2] Bonilla J V , Srivatsa G S .Handbook of analysis of oligonucleotides and related products[M].CRC Press,2011.

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